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碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ,CA)試劑盒說明書
點(diǎn)擊次數(shù):1033 更新時(shí)間:2023-10-11

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase ,CA)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:

碳酸酐酶(CarbonicAnhydrase ,CA)是一種含鋅金屬酶,迄今在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)至少有  11種同工酶,它們的結(jié)構(gòu)、分布、性質(zhì)各異, 多與各種上皮細(xì)胞泌H-和碳酸氫鹽有關(guān),通  過催化CO2水化反應(yīng)及某些脂、醛類水化反應(yīng), 參與多種離子交換 ,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。 測定原理:

碳酸酐酶具有酯酶活性, 可催化乙酸對硝基苯酯反應(yīng)生成對硝基苯酚, 通過檢測 405nm 處 吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自備的儀器和用品:

酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體 50mL×2 瓶, 4℃保存;

試劑一:液體 20mL×1 瓶, 4℃保存;

試劑二: 粉劑×1 瓶, -20℃避光保存; 臨用前加入 5mL 試劑三,充分溶解待用, 用不完的 試劑繼續(xù)-20℃避光保存。

試劑三:液體 6mL×1 瓶, 4℃保存。

樣品測定的準(zhǔn)備:

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 (104 個(gè)): 提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液), 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3S,間隔 10S,重復(fù)

30 次) ;8000g ,4℃離心 10min,取上清, 置冰上待測。

2、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液) ,冰浴中勻漿。 8000g  ,4℃離心 10min,取上清, 置冰上待測。 測定步驟

1 、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min,調(diào)節(jié)波長至 405nm。

2 、試劑一、試劑二提前 25℃預(yù)熱 10min。

3 、取 96 孔板,依次加入 20μL 樣本上清, 140μL 試劑一, 最后加入 40μL 試劑二。立刻混 勻, 測定 405nm 下 3min 處吸光值 A1  與 6min 處吸光值 A2 ,ΔA=A2-A1


CA 活力計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 1.0424x + 0.001,R2 = 0.9994;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μmol/mL), y 為吸光值。

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 對硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。

CA 活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(V 樣×Cpr)÷T×1000 =319.77×(ΔA-0.001) ÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol  對硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。 CA 活性(nmol/min/g  鮮重)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000



=319.77×(ΔA-0.001) ÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義: 每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol  對硝基酚定義為一個(gè)酶活力單位。

CA 活性(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.001) ÷1.0424×V 樣÷(500 ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000 =0.639×(ΔA-0.001)

V 樣: 加入樣本體積: 0.02mL;V 樣總: 加入提取液體積, 1 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度, mg/mL;W:樣本質(zhì)量, g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù), 500 萬; T:反應(yīng)時(shí)間, 3min;1000,μmol 到nmol 的換算系數(shù)。

2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色十余年,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

如果您受時(shí)間、試驗(yàn)條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

 

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

 



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