維生素E(Vitamin E,VE)試劑盒說明書
分光光度法 50 管/24 樣
注意:正式測定之前選擇2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義
維生素E(Vitamin E)是一種脂溶性維生素,其水解產(chǎn)物為生育酚,是生物體中主要的抗
氧化劑之一,能阻止不飽和脂肪酸收到過氧化作用的損傷,維持不飽和脂肪酸細胞膜的完整
性和正常功能,具有延緩衰老、預(yù)防溶血性貧血作用,在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品行業(yè)
具有較高的應(yīng)用價值。
測定原理
VE 還原Fe3+為Fe2+,F(xiàn)e2+與1,10-菲羅啉產(chǎn)生有色絡(luò)合物,在530nm 有特征吸收峰。
自備實驗用品及儀器
天平、研缽、離心機、可見分光光度計、1 mL 玻璃比色皿、漩渦震蕩儀。
試劑組成和配制
提取液:液體100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體5mL×1 瓶,4℃避光保存。
試劑二:液體5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:液體5mL×1 瓶,4℃保存。
試劑四:液體15mL×1 瓶,4℃保存。
樣本處理
1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.2g,加入1mL
提取液)加入提取液,充分勻漿后用提取液定至2mL,在漩渦混勻儀上震蕩5min,于
25℃,5000g 離心10min,取上層測定。
2. 細胞:按照細胞數(shù)量(104 個):提取液體積(mL)為500~1000:1 的比例(建議1000
萬細胞加入2mL 提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3 秒,間隔7 秒,
總時間3min);在漩渦混勻儀上震蕩5min,于25℃,5000g 離心10min,取上層測定。
3. 血清:取0.2mL,加1.9mL 提取液,漩渦儀混勻上震蕩5min,于25℃,5000g 離心10min,
取上層測定。
測定操作
對照管 測定管
樣品(μL) 500 500
試劑一(μL) 100 100
試劑二(μL) 100
試劑三(μL) 100
充分混勻,25℃反應(yīng)5min
試劑四(μL) 300 300
充分混勻,于1mL 玻璃比色皿,無水乙醇調(diào)零,測定530nm 處吸光值,記為A
對照管和A 測定管,△A=A 測定管-A 對照管。
計算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.022x + 0.0065, R2 = 0.9978
1. 按照蛋白含量計算
VE 含量(μg/mg prot)=(△A -0.0065)÷ 0.022×V 反總÷(V 樣×Cpr)
= 181.8×(△A -0.0065)÷ Cpr
2. 按照樣本質(zhì)量計算
VE含量(μg/g)=(△A -0.0065)÷ 0.022×V反總÷(V樣×W÷V樣總)
= 181.8×(△A -0.0065)÷ W
3. 按照細胞數(shù)量計算
VE含量(μg/104 cell)=(△A -0.0065)÷ 0.022×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總)
= 181.8×(△A -0.0065)÷ 細胞數(shù)量
4. 按照液體體積計算
VE含量(μg/mL)=(△A -0.0065)÷ 0.022×V反總÷V樣×20
= 1818×(△A -0.0065)
V反總:反應(yīng)總體積,1mL;:V樣:加入樣本體積,0.5mL;V樣總:加入提取液體積,2mL; Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g
注意事項
1. 若反應(yīng)體系產(chǎn)生沉淀,需要將樣品進行適當(dāng)?shù)南♂專⒃谟嬎愎街谐艘韵♂尡稊?shù)。
2. 低檢出限為29.5μg/g。